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Etude de la méthylation en cancérologie : quelles techniques en pratique clinique ?

Julie Leclerc, Lille – Fabienne Escande, Lille

© Edimark – Correspondances en Onco-Théranostic, Vol XIV – n° 2

Agissant sans changer la séquence nucléotidique et donc le code génétique et assurée par la famille des ADN-méthyltransférases (DNMTs), la méthylation de l’ADN est l’un des mécanismes de régulation de l’expression des gènes chez les mammifères. On parle d’épigénétique. En cancérologie, les cellules tumorales présentent une hypométhylation globale de leur génome avec, cependant, des régions particulières hyperméthylées. L’hypométhylation se produit à proximité de séquences hautement répétées, contribuant à l’instabilité chromosomique et à la réactivation d’éléments transposables, tandis que l’hyperméthylation des promoteurs des gènes suppresseurs de tumeurs inhibe leur expression, soutenant le développement et la progression tumorale. En outre, la surexpression de certains acteurs importants, comme les DNMTs, permet à ces cellules de maintenir les schémas aberrants de méthylation de l’ADN pendant la réplication. Ces adaptations assurent le maintien de la dérégulation épigénétique et contribuent à la tumorigenèse. Le profil spécifique d’hypométhylation et d’hyperméthylation peut non seulement constituer un biomarqueur utile pour la détection précoce des cancers, mais apporte également des informations sur les mécanismes sous-jacents du développement du cancer, sur la cellule d’origine, sur le pronostic des patients, tout en permettant d’envisager certaines options thérapeutiques.

L’étude de la méthylation de gènes tels que MGMT, MLH1, RAD51C ou BRCA1 est aujourd’hui réalisée en pratique clinique en cancérologie. Plus récemment, l’analyse de profils de méthylation plus larges a également été mise en place dans les laboratoires diagnostiques. Différentes techniques moléculaires peuvent être utilisées pour réaliser ces analyses : certaines sont adaptées à l’étude du taux de méthylation à l’échelle d’un CpG unique ou d’une région, alors que d’autres vont permettre l’étude du méthylome. Le choix de la technique dépendra des objectifs de l’étude (analyse ciblée ou globale), de la couverture et de la résolution souhaitées, de la quantité et qualité de l’ADN disponible (ADN extrait de tissu FFPE, ADN circulant), de la sensibilité et de la spécificité attendues, ainsi que de la disponibilité des équipements et du coût de la technique. Les avantages et les inconvénients de ces techniques définissent leurs domaines d’applications.

Mots-clés : Méthylation – Cancer – PCR digitale – Séquençage de 3e génération – Puces à ADN.

  1. Prétraitement de l’ADN
  2. Techniques d’analyse de la méthylation

Prétraitement de l’ADN

Bien qu’aujourd’hui il soit possible d’étudier le profil de méthylation à partir d’ADN natif (cf. paragraphe Séquençage de 3e génération), la grande majorité des techniques nécessite un traitement préalable de l’ADN. Cette étape est primordiale et doit être parfaitement maitrisée, car elle peut générer des résultats faussement positifs. Ce prétraitement est généralement chimique ou enzymatique. Il est également possible d’utiliser des techniques de capture par affinité (non développées ici).

Traitement chimique

Cette technique, développée dans les années 1990, est fondée sur l’utilisation du bisulfite de sodium qui, par une réaction de désamination, permet de convertir les cytosines (C) non méthylées en uraciles (U) : après une étape de dénaturation de l’ADN (thermique ou chimique), une étape de conversion (attaque nucléophile du carbone 6 de la cytosine puis désamination du carbone 4) est réalisée, suivie d’une étape de désulphonation. Contrairement aux C, les 5-mC, qui sont protégées de l’attaque nucléophile par leur groupement méthyl qui bloque l’accès du bisulfite, ne sont pas converties. Après amplification par PCR, les C converties seront détectées comme des thymines (T), alors que les 5-mC resteront des C 4. À noter que cette technique convertit également les 5-hydroxyméthylcytosines essentiellement présentes dans les tissus embryonnaires, le foie et le cerveau, mais le biais induit est considéré comme négligeable 5.

La conversion au bisulfite a longtemps été considérée comme le gold standard pour l’étude de la méthylation et constitue la 1re étape de nombreuses techniques. Elle présente néanmoins des inconvénients, notamment pour des ADN de qualité médiocre comme ceux issus de tissus fixés au formol et inclus en paraffine (FFPE). En effet, le traitement au bisulfite est réalisé dans des conditions de température et de pH entraînant une surfragmentation de l’ADN et une perte de matériel par dégradation 6. La persistance de résidus chimiques et une dénaturation incomplète de l’ADN peuvent altérer l’efficacité de la conversion. Il est donc indispensable de s’assurer de l’absence de biais liée à une conversion incomplète. Différents kits de conversion avec des protocoles optimisés pour l’ADN FFPE sont aujourd’hui disponibles sur le marché. Des différences significatives en termes de fragmentation de l’ADN, d’efficacité de conversion [Figure 1 a & b] et de rendement sont observées entre ces kits 7.

Après conversion, les brins d’ADN ont perdu leur complé­mentarité. L’ADN reste donc simple brin et doit être conservé à −20° C ou −80° C. Les cycles de congélation/décongélation ne sont pas recommandés.

Traitement enzymatique

Les méthodes enzymatiques offrent une alternative au traitement au bisulfite et ne sont pas sujettes aux mêmes pertes de matériel. Elles sont fondées sur l’utilisation d’enzymes de restriction (HpaII, AatII, ClaI, etc.) sensibles à la méthylation (MSRE) qui vont couper ou non l’ADN en fonction de son statut méthylé ou non méthylé. Les 2 inconvénients majeurs de ces techniques sont la nécessité d’un chevauchement entre régions d’intérêt et sites de restriction, et le risque non négligeable de digestion incomplète.

Techniques d’analyse de la méthylation

Le choix de la technique dépendra des objectifs de l’étude (analyse ciblée ou globale), de la couverture et de la résolution souhaitées, de la quantité et de la qualité de l’ADN disponible (ADN FFPE, ADN circulant), de la sensibilité et de la spécificité attendues, ainsi que de la disponibilité des équipements et du coût de la technique [Tableau 1].

Analyse ciblée

MS-PCR et techniques dérivées

La technique de methylation-specific PCR (MS-PCR) est fondée sur l’amplification sélective de la séquence cible grâce à l’utilisation de 2 couples d’amorces, l’un permettant l’amplification de la séquence méthylée et l’autre de celle non méthylée 8. Deux réactions PCR sur ADN converti sont donc réalisées en parallèle. Le choix des amorces est crucial puisqu’il conditionne la spécificité de la technique 3. Dans sa version originale, les produits de PCR étaient ensuite analysés par migration sur gel. Aujourd’hui, de nombreuses variantes ont été développées, permettant une approche semi-quantitative ou quantitative de l’allèle méthylé ainsi qu’une amélioration de la spécificité et de la sensibilité de la technique : MS-PCR couplée à de l’analyse de fragments (amorces de PCR fluorescentes), ou MS-PCR en temps réel (qMSP). C’est le cas de la technique MethyLight qui associe des amorces spécifiques à des sondes d’hydrolyse de type TaqMan®. Grâce à l’analyse des Ct (séquence cible/gène de référence), une quantification de la méthylation peut être réalisée 9. D’autres solutions commerciales de qMSP émergent actuellement, permettant l’analyse de l’ADN sans prétraitement grâce à l’utilisation d’amorces modifiées, capables de se fixer préférentiellement sur les séquences méthylées 10.

L’inconvénient majeur de ces techniques est l’absence d’information du statut méthylé à l’échelle d’un seul site CpG. Néanmoins, il s’agit de techniques peu coûteuses et utilisant un équipement souvent disponible dans les laboratoires.

[Figure 1]
Analyse de la méthylation du promoteur du gène MLH1 dans l’ADN extrait de la tumeur de 3 patients


A. Résultats obtenus par pyroséquençage (PyroMark MLH1, Qiagen) après conversion avec le kit EZ DNA Methylation, Zymo Research (dénaturation chimique de l’ADN).
B. Résultats obtenus par pyroséquençage (PyroMark MLH1, Qiagen) après conversion avec le kit EZ DNA Methylation Gold, Zymo Research (dénaturation thermique de l’ADN).
C. Résultats obtenus par PCR digitale (amorces maison) après conversion avec le kit EZ DNA Methylation.

La comparaison A et B montre l’influence du protocole de conversion sur le taux de méthylation. Avec le kit EZ DNA Methylation, le taux de méthylation est constamment élevé pour les 2 premiers CpG, ne permettant pas leur prise en compte dans le calcul. La comparaison avec C montre l’intérêt de la PCR digitale pour les échantillons peu riches en cellules tumorales. Pour les patients 2 et 3 (~10 % de cellules tumorales) négatifs par pyroséquençage (< au seuil de 8 %), le résultat reste négatif par PCR digitale pour le patient 2 (<  au seuil de 0,1 %) mais devient positif pour le patient 3.

MS-HRM

Avec la technique de methylation-sensitive high resolution melting (MS-HRM, courbe de fusion à haute résolution), la différenciation entre les produits PCR obtenus sur ADN méthylé et non méthylé (après conversion au bisulfite) repose sur leur différence de température de fusion et l’obtention de courbes de dissociation différentes. En comparant la courbe de l’échantillon à analyser à celles obtenues pour différentes dilutions d’un échantillon de référence, il est possible d’estimer le taux de méthylation de l’échantillon. Il s’agit d’une technique simple qui ne nécessite qu’un seul couple d’amorces de PCR. Sa sensibilité peut néanmoins varier selon la région à analyser, la longueur de l’amplicon, les méthodes d’extraction et la qualité de l’ADN 11.

[Tableau 1]
Les principales techniques moléculaires utilisées en pratique clinique
+ faible ; ++ moyenne ; +++ haute ; ++++ très haute.

MS-MLPA

La methylation-specific multiplex ligation-dependent probe amplification (MS-MLPA) a été décrite pour la 1re fois en 2002. Il s’agit d’une technique de quantification relative dont le principe est fondé sur l’hybridation de 2 oligonucléotides adjacents sur la séquence cible. Après ligation, ces 2 oligonucléotides vont former une sonde unique. Une étape de digestion enzymatique par MSRE est effectuée, suivie d’une amplification PCR : seules les sondes non digérées seront amplifiées. Le pourcentage de méthylation est évalué en comparant le niveau d’amplification des sondes avec et sans digestion. L’avantage de cette technique, commercialisée par la société MRC Holland, est qu’elle n’utilise pas le bisulfite de Na. De plus, elle peut permettre d’évaluer simultanément le nombre de copies (CNV) ou la présence de variants ponctuels. Son inconvénient majeur est le manque de sensibilité.

Pyroséquençage

Il s’agit d’une technique de séquençage quantitative 12. Après conversion de l’ADN, une amplification de la séquence cible, indépendamment de son statut de méthylation, est réalisée avec un couple d’amorces en dehors des sites CpG. Après purification, un séquençage par synthèse est réalisé, fondé sur la libération de pyrophosphate lors de l’intégration d’une base et la production de lumière par cascade enzymatique. Pour chaque site CpG dans la séquence analysée, le pourcentage de méthylation est calculé par le rapport d’intensité des signaux : C (signal méthylé)/C+T (signal méthylé + non méthylé). Grâce à cette technique, il est possible d’analyser des régions de 50 à 80 pb. Un des principaux avantages est la possibilité d’effectuer une mesure quantitative des taux de méthylation pour chaque CpG analysé. Cette technique présente également une bonne sensibilité et une bonne ­reproductibilité. Son coût reste néanmoins plus élevé que celui de techniques fondées sur la PCR en raison des réactifs spécialisés et des équipements nécessaires.

Cette méthode a longtemps été considérée comme le gold standard pour l’analyse de la méthylation de certains biomarqueurs 3. Pour le statut de méthylation du gène MGMT, par exemple, il a été montré que l’étude des CpG 74 à 78 par le pyroséquencage permettait d’obtenir les meilleures valeurs prédictives de réponse au traitement par le témozolomide chez les patients atteints de glioblastome 13. Cinq techniques (immuno­histochimie, MethyLight, MS-PCR, pyro­séquencage et MS-HRM) avaient alors été testées dans une étude rétrospective impliquant 8 centres français. Une étude prospective avait ensuite confirmé ces résultats 14. Aujourd’hui, l’utilisation du pyro­séquençage décroît du fait de la plus faible disponibilité des appareils (pyro­séquenceurs) et du développement de techniques plus sensibles.

PCR digitale

La PCR digitale est une technique en pleine expansion. Elle est fondée sur le partitionnement de l’échantillon en milliers de réactions de PCR individuelles, chacune analysée indépendamment 3, 15. Les applications de la PCR digitale dans le cadre de l’analyse de la méthylation sont nombreuses. Du fait de sa grande sensibilité, elle est particulièrement adaptée aux échantillons tumoraux présentant un faible pourcentage de cellules tumorales [Figure 1], à l’analyse de l’ADN circulant, et également pour certaines analyses constitutionnelles comme la recherche d’épimutation constitutionnelle du gène MLH1 pouvant être présente à taux très faible chez certains patients atteints de syndrome de Lynch (données non publiées). Elle permet également une quantification absolue du taux de méthylation et la détermination du nombre de copies d’ADN analysées dans un échantillon, évitant ainsi le risque de faux négatifs par nombre insuffisant de copies analysées.

La détection de la méthylation par PCR digitale est généralement réalisée avec des sondes de type TaqMan à partir d’ADN converti au bisulfite de sodium, mais des protocoles MSRE existent également.

Analyse globale

Bien que la technique de whole genome bisulfite sequencing (WGBS) ou les techniques alternatives de type methylated DNA immunoprecipitation sequencing (MeDiP) ou reduced representation bisulfite sequencing (RRBS) soient les techniques de référence pour l’étude de profils de méthylation à plus grande échelle, elles ne sont pas utilisées dans le cadre du soin. Seules les techniques sur puces à ADN et le séquençage de 3e génération ont aujourd’hui des applications en routine clinique 16.

Puces à ADN

Les technologies sur puces à ADN permettent l’analyse simultanée de centaines de milliers de positions nucléotidiques par hybridation. La plateforme la plus utilisée actuellement est sans doute celle proposée par la société Illumina, avec la solution Infinium Human Methylation qui existe depuis 2008. Aujourd’hui, la version V2 des puces EPIC (935K) offre la possibilité d’étudier plus de 930 000 sites CpG répartis sur l’ensemble des chromosomes, dans les séquences codantes ou non codantes des gènes mais également en régions intergéniques. Le principal avantage de cette technique, qui nécessite un traitement préalable des ADN au ­bi­sulfite de sodium, est la possibilité de travailler sur l’ADN FFPE, dès 50 ng si le prélèvement est suffisamment riche en cellules tumorales et l’ADN de qualité suffisante 17. Après amplification, l’ADN converti est déposé sur une puce où se trouvent les sondes d’hybridation complémentaires des régions d’intérêt 18. Une extension d’une seule base est réalisée avec un nucléotide marqué permettant la détection d’une fluorescence rouge ou verte en fonction de la base incorporée et du statut de méthylation. Le signal de fluorescence est ensuite mesuré et 2 fichiers numériques de type .idat (intensity DATA) sont générés pour chaque patient (Red et Green). Ces fichiers contiennent, pour chaque motif CpG analysé, l’information de l’intensité des signaux de fluorescence qui sera ensuite convertie en pourcentage de méthylation. Bien que la technique soit assez lourde techniquement (3 jours), son succès tient à la quantité importante de données publiques disponibles aujourd’hui. Couplées à des algorithmes de machine learning, ces données ont permis l’établissement de classifications tumorales dont certaines sont facilement accessibles en ligne. C’est le cas de la classification des tumeurs cérébrales du German Cancer Research Center (DKFZ)1 ou du National Institutes of Health2. Il est également possible d’extraire l’information de certains CpG d’intérêt isolément. Le classifier DKFZ propose d’ailleurs un score de méthylation du gène MGMT à partir de l’analyse des sites CpG31 et CpG84 19. Les sites analysés pour établir ce score sont différents de ceux utilisés, par exemple, en pyroséquencage (CpG 74 à 78) avec de possibles ­discordances 20. De façon intéressante, cette technologie permet également de faire une analyse des CNV en comparant les données de fluorescence globale du patient à un set d’échantillons de référence.

La principale limitation de ces technologies sur puces à ADN est le pourcentage de couverture du génome. Dans la version V2 des puces EPIC, les sites analysés ne représentent qu’environ 3,5 % des sites CpG totaux. Ces sites sont par ailleurs choisis par le fournisseur, sans possibilité de design à façon.

Séquençage de 3e génération

Le séquençage de 3e génération, représenté majoritairement par les technologies commercialisées par PacBio et Oxford Nanopore Technologies (ONT), offre une nouvelle dimension dans l’étude de la méthylation de l’ADN, en analysant des molécules d’ADN individuelles en temps réel. Contrairement aux approches précédentes nécessitant un prétraitement de l’ADN, ces technologies détectent directement les modifications chimiques de l’ADN (méthylation, hydroxy­méthylation, acétylation, etc.) et ce, sans aucune étape préalable (bisulfitation ou coupure enzymatique). La technologie développée par ONT est actuellement la plus répandue. Le principe repose sur la détection d’une variation du flux ionique induite par le passage d’une molécule d’ADN à travers un pore protéique. L’intensité du courant varie en fonction de la nature des bases et de leur modification chimique. Le principal avantage de cette technologie est de permettre le séquençage de l’ADN natif, sans amplification ni marquage. Cependant, elle est, pour l’instant, principalement applicable à l’ADN extrait de tissu congelé ou l’ADN circulant, car elle nécessite de l’ADN de bonne qualité. Le séquençage en temps réel est également un atout puisqu’il pourrait permettre un diagnostic ultra-rapide “au lit du malade” 21.

Conclusion

Si jusqu’à récemment les approches ciblées étaient les seules développées en laboratoire de routine, l’apport des profils globaux de méthylation dans la prise en charge des patients en cancérologie a entraîné le déploiement de techniques telles que les puces à ADN et le séquençage de 3e génération. Le développement de techniques ultra-sensibles, telle que la PCR digitale, et de techniques sans prétraitement de l’ADN offre également de nouvelles perspectives en termes d’applications.

Quelle que soit la technique choisie, ciblée ou globale, une validation rigoureuse de celle-ci est nécessaire avec une évaluation de l’impact de la qualité et la quantité d’ADN et du pourcentage de cellules tumorales de l’échantillon à étudier. Il est également nécessaire de s’assurer de la concordance et la reproductibilité des résultats entre les différents laboratoires. Dans ce cadre, le choix des CpG étudiés a une grande importance, et l’absence de standardisation limite souvent la reproductibilité des résultats.

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